Oral tpe
Comment met on en évidence le polymorphisme de l’ADN
L’ADN est extrait d’un petit échantillon
Il est coupé par une enzyme de restriction appropriée
Les fragments obtenus, caractéristiques de chaque personne, sont séparés, selon leur taille, par électrophorèse
Certains fragments bien précis sont séparés à l’aide d’une « sonde » radioactive
Leur position, variable selon les individus estalors visualisée sur un film photographique
Pour mieux comprendre et visualiser le déroulement voici les étapes décrites et détaillées qui permettent de mettre en évidence le polymorphisme de l’ ADN.
Purification et extraction:
Dès que le laboratoire génétique reçoit les échantillons biologiques prélevés, tous les scientifiques se mettent au travail afin d’en extraire l’ADN.
Le protocoleexpérimental général de l’extraction est le suivant :
Tout d’abord, on commence par une lyse des cellules, puis une élimination des protéïnes et des acides nucléiques autres que l’ADN tels que l’ARN etc… Enfin, on fait une concentration de l’ADN par une précipitation à l’alcool (éthanol)
Il y a de nombreux types d’ADN qui varient selon leur provenance, par exemple de l’ADN génomique, c’est-à-direen provenance des chromosomes, ou bien de l’ADN plasmidique, c’est-à-dire provenant de plasmides (le plus souvent portés par des cellules bactériennes).
Différentes variantes d’extraction sont utilisées en fonction de la provenance de l’ADN.
Nous ne verrons ici que l’extraction de l’ADN génomique, seul porteur de l’information génétique.
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR:
La «PolymeraseChain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication de l’ADN.
Elle permet d’obtenir, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie. L’ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures. C’est, généralement, suffisantpour une utilisation ultérieure.
Une PCR classique se déroule dans un tube placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur. Le thermocycleur place le tube aux températures voulues pendant les durées programmées et recommence en effectuant des cycles. Un cycle représente trois températures différentes pendant des durées différentes.
Avant la réaction, tous les « acteurs » de la PCRsont introduits dans le même tube. Il s’agit :
– du fragment d’ADN à amplifier,
– des amorces (ou oligonucléotides), dont la séquence est complémentaire à celle des extrémités du fragment d’ADN de manière à pouvoir s’hybrider avec elles.
– de l’ADN polymérase (ici Taq polymérase)
– du mélange des quatre nucléotides constitutifs de l’ADN.
Tous sont ajoutés enlarge excès par rapport à l’ADN. Le choix des amorces est très important car ce sont elles qui vont délimiter le début et la fin de la séquence à amplifier.
Déroulement d’un cycle :
Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation.
Première phase : dénaturation t = 95°c
A cettetempérature, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d’ADN sont rompues pour donner deux simples brins d’ADN.
Seconde phase : hybridation t = 45-60°c
L’hybridation des amorces sur l’ADN repose sur le principe de l’assemblage des bases complémentaires.
Le choix de la température d’hybridation résulte d’un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée enfonction de la longueur et de la séquence des amorces.
La température d’hybridation est, de toute façon, inférieure à la température de dénaturation.
Troisième phase : élongation (extension des amorces) t=72°c
Les amorces hybridées à l’ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d’ADN complémentaire de l’ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des…