Lois de la svt

4. Effet de la concentration d’enzyme Lorsque [enzyme] Km et donc (13) [S]/([S] + Km) tend vers 1. Il s’ensuit que Vmax = k3[E]totale La substitution de l’éqn 13 dans l’éqn 12 donne l’équation de MichaelisMenten: [S] (14) V =V
max

[S] + K m

L’équation de Michaelis-Menten décrit la courbe cinétique de Vo-[S]: – Pour des concentrations faibles de substrat, lorsque [S] >Km, V = Vmax et lavitesse est indépendante de la concentration de substrat. – La signification de la constante Km est évidente. Lorsque [S] = Km, V = Vmax/2. Km est la concentration de substrat nécessaire pour que 133 l’enzyme atteigne (1/2) Vmax.

Méthodes graphiques pour la détermination de Km et Vmax
Il y a deux régions d’utilité analytique dans la courbe cinétique de – [S] < 0.1Km (pour la quantification dusubstrat) Vo-[S]: - [S] > 10Km (pour la quantification d’enzyme) Dans le développement d’un essais enzymatique, il est important de connaître la valeur de Km de l’enzyme et d’ajuster la valeur de Vmax afin que l’essais est accompli dans le minimum de temps requis pour une précision donnée. Il y a quatre méthodes graphiques pour établir les valeurs de Km et Vmax dans des conditions expérimentalesdonnées: Lineweaver-Burk, EadieHofstee, Hanes et Cornish-Bowden-Eisenthal. Les quatre méthodes nécessitent des données expérimentales pour la vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration initiale du substrat pour une concentration fixe d’enzyme.
134

Données cinétique
0.6 0.5
Vo (?A340nm/min)

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
0 1 2 3 4 [S] mmol/L 5 6 7
135

1. Méthode deLineweaver-Burk
Le réciproque de l’équation de Michaelis-Menten est très utile pour l’analyse des données de cinétique:

1 K m + [ S] = Vo Vmax ? [S]

qu’on peut aussi écrire

1 Km [S ] = + Vo Vmax ? [S] Vmax ? [S]

et qui se simplifie en

1 1 1 K = + m ? Vo Vmax Vmax [S]

L’avantage de cette transformation mathématique est qu’elle permet de tracer un graphique 1/Vo vs 1/[S] dont la courbe esten fait une droite pour les enzymes obéissant à la relation Michaélienne entre vitesse de réaction et concentration du substrat.
136

Y = (1.12551±0.08398) + (3.79517±0.06135) * X

14 12 10
Km/Vmax

1/Vo

8 6 4 2
Km = 3.37 mmol/L Vmax = 0.89 unités d’absorption/min 1/Vmax

0 -0.5 0.0 -1/Km

0.5

1.0

1.5 2.0 1/[S]

2.5

3.0

3.5
137

2. Méthode de Eadie-Hofstee
V =Vmax [S] [S] + K m
V [S] + VK m = Vmax [S]

Équation de Michaelis-Menten

V [S] VK m + = Vmax [S] [S]

V = Vmax ?

VK m [S]

Un graphique de V en fonction de V/[S] donne une droite.

138

Y = (0.90851±0.03984) + (-3.46041±0.22103)*X
1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 Vo 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.00 0.05 0.10 0.15 Vo/[S]
139

Vmax

Km = 3.46 mmol/L Vmax = 0.91 unités d’absorption/min

-Km0.20

0.25

0.30

3. Méthode de Hanes
V = Vmax [S] [S] + K m
V ([S] + K m ) = Vmax [S]

Équation de Michaelis-Menten

K m + [S] [S] = Vmax V

[S] K m [ S] = + V Vmax Vmax

Un graphique de [S]/V en fonction de [S] donne une droite.

140

Y = (3.74211±0.11868) + (1.13445±0.03865)*X
12 11 10 9 [S]/Vo 8 7 6 5 4 0

1/Vmax

Km = 3.30 mmol/L Vmax = 0.88 unitésd’absorption/min Km/Vmax
1 2 3 4 [S] 5 6 7

141

4. Méthode de Cornish-Bowden-Eisenthal
V = Vmax [S] [S] + K m
Vmax [S] = V [S] + VK m

Équation de Michaelis-Menten

Vmax =

VK m +V [S]

Chaque paire de coordonnées (V, [S])] donne des valeurs uniques d’ordonné à l’origine (V) et de pente (V/[S]) dans un graphique de Vmax en fonction de Km. Pour chaque coordonnée (V, [S])], les valeurs d’ordonnée àl’origine et de pente définissent une droite unique et les droites se croiseront à un point identique correspondant au Vmax et Km de l’enzyme.
142

1.6 1.4 1.2 1.0 Vmax 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 1 2 3 Km
143

Faire la moyenne des différents points de croisement

4

5

6

3.7 Inhibiteurs enzymatiques
Des inhibiteurs enzymatiques sont des espèces qui sont capables de diminuer…